Konstytucyjna aktywacja katalitycznej jednostki PKA w zespole nadnerczy AD 6

Funkcjonalna charakterystyka wariantów PRKACA. Panel A pokazuje strukturę wyprowadzoną z tetrameru kinazy białkowej A (PKA), z niezmutowaną katalityczną podjednostką (C?) przedstawioną na zielono i regulacyjną podjednostką (RII?) przedstawioną na czerwono. Wyświetlany jest powiększony widok na obszar Leu206 w podjednostce C. Leu206 jest przedstawiony jako wypełniająca przestrzeń reprezentacja; dwie reszty w bliskim sąsiedztwie (Val115 i Tyr228) i dodatkowe reszty z miejsca hamującego (Arglll-Ser114, oznaczone gwiazdką) podjednostki regulacyjnej są przedstawione jako pałeczki. Panel B pokazuje ten sam region tetrameru PKA, przy czym Leu206 w podjednostce C? zastąpiono Arg206, także przedstawionym jako wypełnienie przestrzeni. Panel C pokazuje aktywność PKA nie zmutowanych i zmutowanych podjednostek PKA C? transfekowanych w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293, co określono za pomocą testu przeniesienia energii rezonansu fluorescencji ( FRET) z reporterem PKA (szczegóły, patrz fig. S4 w dodatkowym dodatku). . Wyniki wskazują, że zmutowane warianty są konstytutywnie aktywne. Gwiazdki wskazują P <0,05 dla porównania z Ca-mutanta + RII?. AKAR4-NES oznacza reporter aktywności białka 4 z sygnałem eksportu jądrowego. Panel D pokazuje, że wysoką konstytutywną aktywność PKA utrzymywano, gdy mutant był kotransfekowany taką samą ilością nieumotywowanej podjednostki Ca. Gwiazdki wskazują P <0,05 dla porównania z Ca-mutanta + RII?. Dane w panelach C i D porównano za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji, a następnie testu Bonferroniego. Panel E pokazuje kwantyfikację enzymatycznej aktywności PKA; Komórki COS-7 transfekowano C? (nie zmutowany lub zmutowany) i RII?, z dodatkiem lub bez dodatku cyklicznego AMP (cAMP). Gwiazdki wskazują P <0,05 dla porównania próbek z tymi bez dodatku cAMP. Znak kreskowania wskazuje P <0,05 dla porównania pomiędzy próbkami transfekowanymi nieumotywującą podje dnostką Ca i tymi transfekowanymi zmutowaną podjednostką Ca bez dodawania cAMP. W panelach C, D i E pręty I reprezentują błąd standardowy. Analiza pełnej długości struktury tetramerycznej RII? (2): C? (2) holoenzymu23 ujawniła, że ta mutacja znajduje się w wysoce konserwowanym rdzeniu oddziaływania między regulatorową (RII?) i katalityczną (C?) podjednostką PKA - odkrycie który wspiera funkcjonalne znaczenie wariantu Leu206Arg. Leu206 jest częścią rozszczepienia miejsca aktywnego katalitycznej podjednostki, do której przyłącza się sekwencja hamująca podjednostki regulacyjnej, naśladując substrat dla podjednostki katalitycznej. Ta interakcja utrzymuje nieaktywną katalityczną podjednostkę w nieobecności cAMP. Wymiana Leu206 z obszernym i dodatnio naładowanym aminokwasem Arg in silico daje steryczną przeszkodę między bocznym łańcuchem zmutowanego Arg206 w podjednostce Ca i Val115 i Tyr228 w podjednostce RII? (Figura 2A i 2B) .29
Konsekwenc je funkcjonalne dwóch wykrytych wariantów (Leu206Arg i Leu199_Cys200insTrp) badano w nienaruszonych komórkach za pomocą mikroskopii FRET z użyciem czujnika aktywności PKA (AKAR4-NES) .24 Aktywność PKA w komórkach transfekowanych tylko za pomocą niezmutującego C? lub warianty były wysokie i nie były dalej stymulowane przez analogi cAMP, co wskazuje na zachowanie katalitycznej aktywności w mutantach (Figura 2C i Fig. [hasła pokrewne: diacetylomorfina, diacetylomorfina legnica, alfabetyczny spis leków ]

Powiązane tematy z artykułem: alfabetyczny spis leków diacetylomorfina zaburzenia si objawy