Pacjenci z zespolem Cushinga

Pacjentów sklasyfikowano jako mających jawny zespół Cushinga, jeśli mieli co najmniej trzy nieprawidłowe wyniki testów biochemicznych lub jeśli mieli typowe cechy kataboliczne (tj. Osłabienie mięśni, kruchość skóry i osteoporozę) plus co najmniej dwa nieprawidłowe wyniki testów biochemicznych. Uważano, że pacjenci mają endokrynne nieczynne zmiany nadnerczowe, jeśli mieli prawidłowe wyniki biochemiczne i brak objawów katabolicznych. Wszyscy pacjenci, którzy nie mieli objawów katabolicznych, ale mieli co najmniej jeden nieprawidłowy wynik w wyżej wymienionych badaniach, zostali sklasyfikowani jako mający subkliniczny zespół Cushinga. DNA wyekstrahowano w sposób opisany wcześniej19-21 z jednostronnych guzów korowo-nadnerczowych u 181 pacjentów i z odpowiedniej zdrowej tkanki u 26 z tych pacjentów. Ponadto DNA linii płciowej było dostępne dla wszystkich 35 pacjentów z obustronnym rozrostem, a DNA z próbek tkanek nadnerczy uzyskanych pod czas operacji było dostępnych dla 10 z tych 35 pacjentów.
Sekwencjonowanie Exome i PRKACA
Exomy zostały wzbogacone w roztwór i zindeksowane przy użyciu zestawu SureSelect XT Human All Exon 50Mb, wersja 4 (Agilent Technologies). Sekwencjonowanie przeprowadzono jako odczyty na końcu pary 100 pz w systemach HiSeq2000 (Illumina). Pule z 12 indeksowanych bibliotek zostały zsekwencjonowane na czterech pasmach. Analizę obrazu i wywoływanie bazy przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy w czasie rzeczywistym (Illumina). Metody wykrywania wariantów i sekwencjonowania PRKACA opisano w Dodatku uzupełniającym.
Porównawcza hybrydyzacja genomowa
Analiza porównawcza genomowej hybrydyzacji została przeprowadzona z wykorzystaniem komercyjnych macierzy (Agilent Technologies), zgodnie z instrukcjami producenta i zgodnie z wcześniejszym opisem.22 Szczegóły techniczne znajdują się w dodatkowym dodatku.
In Silico Analysis of Human Mutation s
Obrazy strukturalne przygotowano przy użyciu oprogramowania PyMOL (www.pymol.org). Strukturę mysiej pełnej długości tetramerycznego RII? (2): C? (2) holoenzym23 (Protein Data Bank entry 3TNP) zastosowano do prezentacji struktur katalitycznej podjednostki PKA (C?) i regulacyjnej podjednostki (RII?).
Konstrukty DNA i Mutageneza ukierunkowana na miejsce
Plazmidy kodujące niezmutowane ludzkie podjednostki RII? lub C? zakupiono od OriGene Technologies. Plazmid zawierający PRKACA zastosowano do ukierunkowanej mutagenezy, z mutacją C.617A ? C i c.595_596insinsCAC wprowadzoną z użyciem zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na QuikChange II (Agilent Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Mutację potwierdzono za pomocą sekwencjonowania.
Kwantyfikacja aktywności PKA w nienaruszonych komórkach
Ludzkie zarodkowe komórki nerki 293 transfekowano czujnikiem AKAR4-NES (reporter aktywności białka 4 z sygnałem eksportu jądrowego) 24, aby aktywność PKA można było monitorować za pomocą obrazowania metodą rezonansu fluorescencji (FRET) [więcej w: miejsce w kolejce do sanatorium, grzybica pochwy a brak okresu, zaburzenia si objawy ]

Powiązane tematy z artykułem: grzybica pochwy a brak okresu miejsce w kolejce do sanatorium zaburzenia si objawy