Transfekcja i obrazowanie metoda FRET

Transfekcję i obrazowanie metodą FRET przeprowadzono jak opisano wcześniej25. Zastosowano równomolowe stężenia przepuszczalnej dla komórek pary synergicznych analogów cAMP do aktywacji PKA II.26. Kwantyfikacja aktywności enzymatycznej PrKACA i enzymu PKA
Lizaty całych komórek lub tkanek badano pod kątem ekspresji podjednostek PKA C? za pomocą Western blotting z użyciem specyficznego przeciwciała (sc-903, Santa Cruz Biotechnology). Komórki COS-7 transfekowano za pomocą X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche) i 500 ng plazmidowego DNA na studzienkę przez 24 godziny. W przypadku transfekcji obejmujących zarówno podjednostki PKA C? (nie mutanta lub wariant Leu206Arg) i RII?, zastosowano stosunek molowy 1: 8. W zlizowanych komórkach z doświadczeń transfekcji lub komórek pochodzących od pacjenta, aktywność PKA oznaczono za pomocą testu enzymatycznego (Enzo Life Sciences).
Analiza mikromacierzy ekspresji genów i analiza reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR)
Wcześniejsza analiza mikromacierzy 22 gruczolaków27 została rozszerzona o 39 gruczolaków w obecnym badaniu (patrz Tabela S1 w Dodatku Aneks). Do kwantyfikacji ekspresji PRKACA zastosowano ilościową analizę PCR w czasie rzeczywistym. Szczegóły eksperymentów na mikromacierzach i analiza PCR w czasie rzeczywistym są podane w Dodatku Uzupełniającym.
Analiza statystyczna
Dane porównano między dwiema grupami za pomocą testu U Manna-Whitneya i wśród trzech grup za pomocą testu Kruskala-Wallisa. Wszystkie porównania były dwustronne, a wartości P mniejsze niż 0,05 uważano za wskazujące na istotność statystyczną. Analizy przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS, wersja 20 (IBM).
Wyniki
Somatyczne mutacje PRKACA i duplikacje germiny w zmianach wywołujących kortyzol
Sekwencjonowanie egzonu przeprowadzono w próbkach od 10 pacjentów z jednostronnymi gruczolakami wy twarzającymi kortyzol i jawnym zespołem Cushinga (tabela S2 w dodatkowym dodatku) i wykazano niewielką liczbę mutacji somatycznych na gruczolaka (mediana, 5, zakres od do 14) (tabela S3 w Dodatku Uzupełniającym). W obrębie tego małego zestawu zmian genetycznych, warianty somatyczne w PRKACA, kodujące podjednostkę PKA C?, znaleziono w 8 na 10 guzach (c.617A ? C, p.Leu206Arg w 7 i c.595_596insCAC, Leu199_Cys200insTrp w 1). Zaatakowane aminokwasy były wysoce konserwatywne dla różnych gatunków (ryc. S2 w dodatku uzupełniającym).
Ryc. 1. Ryc. 1. Identyfikacja mutacji Somatycznej PRKACA i powielania genetycznego komórek germinalnych. Panel A pokazuje chromatogram sekwencji prawidłowej tkanki nadnerczy, a panel B chromatogramu gruczolaka nadnercza wytwarzającego kortyzol. W gruczole wytwarzającym kortyzol zidentyfikowano mutację somatyczną w PRKACA (c.617A ? C), co powoduje substytucję Leu206Arg, która nie występuje w sąsiadującej prawidłowej tkance [więcej w: dygestorium, Azeloglicyna, asumin ]

Powiązane tematy z artykułem: asumin Azeloglicyna dygestorium